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線栓法MCAO造模實(shí)驗(yàn)解決方案

日期：2013-03-26 20:46:31點(diǎn)擊：0
大腦中動脈阻塞 (middle cerebral artery occlusion，MCAO) 是目前最常用的局灶性腦缺血模型，MCAO 模型先阻斷頸外動脈（ECA）及其分支，且阻斷翼腭動脈（PPA），以切斷顱外來源的側(cè)副循環(huán)血流。從ECA 插入尼龍線，經(jīng)頸內(nèi)動脈（ICA）到大腦前動脈（ACA），機(jī)械性阻斷大腦中動脈（MCA） 發(fā)出處的血供來建立大腦中動脈缺血模型。此模型可在無麻醉狀態(tài)下拔出尼龍線，恢復(fù)血流，實(shí)現(xiàn)再灌注。 線栓法具有不開顱、效果肯定、可準(zhǔn)確控制缺血及再灌注時間的優(yōu)點(diǎn)，用于研究神經(jīng)元對缺血的敏感性、耐受性，藥物療效觀察以及再灌注損害和治療時間窗較為理想，同時也具有對全身影響小、動物存活時間長的特點(diǎn)，適于慢性腦損傷的研究?？刂坪靡鬃円蛩兀杀苊鈱?shí)驗(yàn)結(jié)果的不穩(wěn)定性。
1、主要器材
（1）缺血前準(zhǔn)備：腦立體定位儀、（小鼠適配器）、微量注射泵、微量注射器、顱鉆
（2）缺血模型制作：氣體麻醉機(jī)、異氟烷、體視顯微鏡、冷光源、手術(shù)臺、術(shù)后保溫箱、腦模具、手術(shù)器械包
（3）缺血模型評價：神經(jīng)功能評價法（BBB評分）、TTC染色、病理學(xué)評價
（4）缺血后行為檢測：抓力測試儀、轉(zhuǎn)棒儀......
2、實(shí)驗(yàn)動物
（1）SPF級Wistar大鼠，健康，雄性，體重為250-300g。
（2）SPF級C57小鼠，健康，雄性，體重為18 - 25g，實(shí)驗(yàn)Protocol和視頻，請點(diǎn)擊觀看和下載: Click Here
3、實(shí)驗(yàn)分組
實(shí)驗(yàn)分六組：正常對照組、模型組、陽性藥組、受試藥組三個劑量組，每組15只動物。
4、建模方法（以大鼠為例）
（1）1.5-2%異氟烷氣體麻醉大鼠，頸部備皮，消毒，插入肛溫探頭，保持體溫在37±0.5℃。
（2）頸部正中切口，暴露右側(cè)頸總動脈，頸內(nèi)動脈和頸外動脈。使用6-0絲線在距離頸總動脈分叉4mm處結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)心端，在頸外動脈穿入另一根6-0絲線，在靠近頸總動脈分叉處打一個活結(jié)。
（3）使用動脈夾夾閉頸總動脈。在距離頸總動脈分叉處3mm處的頸外動脈上剪一個小口，將一根頭端處理過的0.33mm直徑的尼龍線從小口中插入，進(jìn)入頸內(nèi)動脈，并向內(nèi)插入大腦中動脈，尼龍線的插入深度距離頸總動脈分叉處約16±1mm。
（4）缺血后90min拔掉線栓，用6-0絲線結(jié)扎外動脈近心端，用3-0絲線縫合頸部傷口，活力碘消毒傷口，將大鼠放在加熱墊上，待清醒后放入恒溫?fù)狃B(yǎng)箱飼養(yǎng)。
（5）術(shù)后24h，對小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，然后繼續(xù)麻醉大鼠，取大腦切片、進(jìn)行TTC染色和病理染色。
5、模型的評價
（1）神經(jīng)功能缺失體征評分
參考 Longa 及Bederson 的5 分制法在動物麻醉清醒后24h 進(jìn)行評分，分值越高,說明動物行為障礙越嚴(yán)重。
0 分：無神經(jīng)損傷癥狀
1分：不能完全伸展對側(cè)前爪
2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈
3分：向?qū)?cè)傾倒
4分：不能自發(fā)行走,意識喪失
（2）TTC染色
麻醉大鼠后 ，取大鼠腦組織 ，放入 -20 ℃冰箱冷凍 30min 30min。用 PBS配置 1% TT C（W/V ），37 ℃水浴至 TTC 溶解， 將凍好的腦組織切片 ，置于 10ml TTC 溶液 中， 37 ℃恒溫孵育 10min。不時翻動腦片，使 組織均勻染色。正常腦染色后呈鮮紅，而梗死區(qū)呈蒼白。
附：小鼠缺血2h后TTC染色效果圖，如下：

（3）病理學(xué)評價
取腦后用 4% 多聚甲醛溶液 固定，蔗糖溶液脫水后經(jīng) 固定，蔗糖溶液脫水后經(jīng) 固定，蔗糖溶液脫水后經(jīng) OCT 包埋做冰凍切片 ，包埋做冰凍切片 ，10um ， 做尼氏染色， 做尼氏染色可做梗死面積的評價。
 
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