腦注射（病毒、細(xì)胞注射......）

日期：2022-03-26 21:38:33點(diǎn)擊：0

以小鼠為例，

一、技術(shù)原理

主要采用腦立體定位技術(shù)，它利用動(dòng)物大腦結(jié)構(gòu)和顱骨表面標(biāo)志（如前囟、后囟、矢狀縫、外耳道、門(mén)齒位等）來(lái)確定大腦皮層下功能性腦區(qū)的X/Y/Z三維坐標(biāo)位置，以便在非直視暴露的條件下植入微電極、注射針、光纖，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行定向的刺激、損毀、藥物注射、電信號(hào)記錄等研究，是腦科學(xué)研究領(lǐng)域常用的重要研究手段。常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如大鼠、小鼠、豚鼠、貓、鳥(niǎo)類(lèi)等，均有上述結(jié)構(gòu)和（或）定位標(biāo)志，在進(jìn)行大腦固定后，即可根據(jù)腦立體定位圖譜或某些參考文獻(xiàn)所提供的數(shù)據(jù)確定目標(biāo)腦區(qū)，進(jìn)行定位、注射等操作。

二、實(shí)驗(yàn)材料

1、腦立體定位圖譜

2、儀器設(shè)備、耗材

3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57成年小鼠，4-6周齡，20-30g。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1、動(dòng)物麻醉
采用異氟烷氣體麻醉，將小鼠放入預(yù)麻箱，調(diào)節(jié)高氣流量和麻醉濃度（約4LPM, 5%），小鼠1分鐘內(nèi)進(jìn)入深麻狀態(tài)（通過(guò)觀察動(dòng)物活動(dòng)狀態(tài)、呼吸、傾斜預(yù)麻箱等方法判斷），取出小鼠，放置于定位儀設(shè)備，進(jìn)行頭部固定；

2、頭部固定
選擇帶有定位儀專(zhuān)用氣體麻醉面罩的小鼠適配器，將小鼠的門(mén)齒扣置于適配器（此時(shí)老鼠置于麻醉面罩的腔內(nèi)，維持麻醉），輕壓鼻梁，前后移動(dòng)適配器，使左右兩側(cè)耳桿中心線與小鼠外耳道位于同一直線上，然后將左、右耳桿分別推入外耳道，調(diào)節(jié)兩耳桿位置中心對(duì)稱(chēng)、且高度一致，螺絲鎖緊固定耳桿。進(jìn)一步地，上下調(diào)整適配器門(mén)齒扣位置，使其位置低于左右耳桿中心連線3.3±0.4mm，前后再次微調(diào)門(mén)齒扣、鼻梁與耳桿之間的位置，壓緊鼻梁，此時(shí)頭部已固定，顱骨水平位基本調(diào)平（注意：這個(gè)是初步判斷標(biāo)準(zhǔn)，還需進(jìn)一步判斷）、且鼻嘴處于適配器的麻醉面罩里、呼吸來(lái)自麻醉機(jī)的氣體維持麻醉（此時(shí)調(diào)節(jié)氣流量約1LPM，濃度約1%，可通過(guò)觀察動(dòng)物呼吸、夾捏尾巴等方法判斷）。
檢查頭部是否固定成功：鼻對(duì)正中，提尾不掉，目測(cè)大腦水平，從上、左、右、側(cè)各個(gè)方向推壓動(dòng)物頭部均不動(dòng)。

3、備皮
備皮前，于眼部涂眼膏。
用剃毛器剔除頭部毛發(fā)，碘伏和酒精棉球消毒，沿矢狀縫作一1cm長(zhǎng)的皮膚切口，分離皮下組織，去除顱骨表面的筋膜及肌肉，推開(kāi)骨膜，生理鹽水和棉球清潔，可清晰暴露前囟、人字縫及矢狀縫。

4、零點(diǎn)定位
定位儀夾持一金屬定位針，將金屬定位針移動(dòng)到矢狀縫上方后，再前后移動(dòng)定位針，使定位針剛好接觸定位到前囟點(diǎn)（Bregma），此步需借助帶LED燈的視頻顯微鏡放大判斷，提高定位準(zhǔn)確性。

5、顱面二次調(diào)平
將定位針從前囟點(diǎn)開(kāi)始，第1步，沿矢狀線向后移動(dòng)到約2.5mm位置、左右各2mm位置，觀察在矢狀線上，定位針在前囟點(diǎn)和2.5mm位置點(diǎn)距顱面是否高度一致，以及在左右2mm位置點(diǎn)，定位針距顱面是否高度一致；第2步，繼續(xù)矢狀線向后移動(dòng)到約4.2mm位置，觀察在矢狀線上，定位針在前囟點(diǎn)和4.2mm位置點(diǎn)距顱面是否高度也一致。這兩步判斷，若不一致，需微調(diào)左右耳桿高度位置、門(mén)齒鼻梁處高度位置；
通過(guò)這個(gè)調(diào)節(jié)，顱面即可確定調(diào)平，讀數(shù)允許誤差±0.03mm。

6、目標(biāo)腦區(qū)定位
首先，從腦立體定位圖譜或文獻(xiàn)確定目標(biāo)腦區(qū)（紋狀體）的三維坐標(biāo)，選取合適坐標(biāo)點(diǎn)（AP+0.98mm,ML+2.0或者-2.0mm,DV-3.0mm），如下圖：

從前囟點(diǎn)開(kāi)始移動(dòng)定位針，在前囟前0.98mm, 矢狀縫左或右旁開(kāi)2.0mm處定位一點(diǎn)，用記號(hào)筆做好標(biāo)記，即為紋狀體在X-Y平面的位置；

7、鉆孔
選取合適大小鉆頭，比注射針稍大一點(diǎn)即可，手持顱鉆，或者將顱鉆夾持固定于定位儀上，在標(biāo)記點(diǎn)處鉆孔。注意：掌握手感，切忌大力，鉆孔突破時(shí)，有明顯的落空感，此時(shí)后退顱鉆，如果再繼續(xù)鉆孔，會(huì)進(jìn)入腦組織，造成損失。另外，建議鉆頭蘸取生理鹽水或PBS進(jìn)行降溫。
鉆孔后，用醫(yī)用注射器的細(xì)針頭小心挑破硬腦膜，防止損傷，如果在此過(guò)程中有出血，可以用很小的醫(yī)藥棉球拉成長(zhǎng)條形將血吸走。

8、夾持注射針
抽取藥物于注射器，夾持于定位儀上，將注射器針頭定位于前囟點(diǎn)處，然后按坐標(biāo)移動(dòng)到鉆孔窗口，繼續(xù)往下緩慢植入注射針。設(shè)置好注射參數(shù)（注射器規(guī)格【容量、活塞內(nèi)徑】、目標(biāo)注射體積、注射速率），即可開(kāi)始注射（參考：紋狀體注射1ul,速率約0.5ul/min；病毒注射1ul，速率約0.2ul/min）。
注射完畢，停針5-10min，使藥物充分?jǐn)U散吸收，再緩慢退針。
注意：如果是病毒、細(xì)胞注射，選擇玻璃電極注射；如果是大容量注射，選擇漢密爾頓注射器注射。

9、動(dòng)物復(fù)蘇
縫合傷口，碘伏消毒，然后將小鼠從定位儀上取下，放置于飼養(yǎng)籠內(nèi)。由于采用的是氣體麻醉，所以動(dòng)物蘇醒很快，約2分鐘。

10、定位點(diǎn)準(zhǔn)確性驗(yàn)證
在開(kāi)展正式藥物注射前，需做預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證目標(biāo)腦區(qū)定位的準(zhǔn)確性。推薦使用示蹤Dil染料（1周后取材檢測(cè)）、熒光金染料（2周后取材檢測(cè)）或者紅色、黑色染料（1周后取材檢測(cè)），然后取材做冰凍切片，對(duì)照腦圖譜的一些參照物來(lái)判斷腦區(qū)定位是否準(zhǔn)確（可以選擇較大、清晰的參照物，比如海馬、側(cè)腦室、視交叉核團(tuán)等）。
注意：切片從外向目標(biāo)核團(tuán)靠近且，注意大腦切片角度與腦圖譜保持一致。

配置清單：

序號(hào)	貨號(hào)	型號(hào)	名稱(chēng)	規(guī)格	單位	數(shù)量
1	10-0030	Nova1000	小動(dòng)物麻醉機(jī)	移動(dòng)型、異氟烷罐、POUR FILL、CAGE MOUNT。一體化集成功能配置：移動(dòng)支架、內(nèi)置氣源泵、抽氣泵、廢氣吸收罐、大小鼠預(yù)麻箱、抽屜箱、置物籃及管路	臺(tái)	1.00
2	10-2203		小鼠定位儀專(zhuān)用面罩-G2		個(gè)	1.00
3	30-1130	SM100D	腦立體定位儀	小鼠、單臂、數(shù)顯	套	1.00
4	20-0190	i-Star300	編程式納升注射泵	毛細(xì)玻璃電極注射	套	1.00
5	19-7010	FASTRONG	顱鉆	0-35000RPM順逆轉(zhuǎn)，腳踏和手控	套	1.00
6	33-0002	PC-100	拉制儀		臺(tái)	1.00
7	33-3003	GN7000	磨針儀		臺(tái)	1.00
8	16-0050	FOI304	LED冷光源	色溫6000K，35W光強(qiáng)可調(diào)	套	1.00
9	16-0020	SM200B	體視顯微鏡	搖臂式雙目	套	1.00
10	18-8010		大腦手術(shù)器械包	13件套	套	1.00
11	18-8090		動(dòng)物手術(shù)消毒套裝	7件套	套	1.00
12	19-7001		小動(dòng)物剃毛器		套	1.00
13	19-7223		紅霉素眼膏	0.5%*2G（5支/包）	包	1.00

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